Отсев характерных колоний на плотную питательную среду с целью получения и накопления изолированных колоний. Чашки инкубируют в анаэробных условиях.

Тема: Микробиологическая диагностика инфекций, вызываемых спорообразующими анаэробными бактериями.

Провести выделение и идентификацию культуры возбудителя, выделенной из глубины раны с подозрением на газовую гангрену.

Микроскопия материала из раны, окраска по Граму, х100	Микроскопия чистой культуры C. рerfringens, окраска по Граму, х100
Результат:	Результат:
РИФ с меченными АТ к C. perfringens	СЭМ. Морфология C. perfringens, х15000
Результат:

Бактериологическое исследование по выделению и идентификации предполагаемого возбудителя с целью установления этиологии заболевания:

Укажите методы отбора и доставки материала при подозрении на анаэробную инфекцию: _____________

1 этап. Посев исследуемого материала на среды культивирования, укажите какие:________________

Посев исследуемого материала на среду Вильсона-Блера и молоко

Ориентировочный ответ о наличии C. perfringens – через 2-4 ч культивирования.

Контроль(-) Образец	Образец Контроль (-)
На среде Вильсона-Блера отмечают почернение среды ввиду восстановления сульфата натрия и образования сульфида железа	На среде с лакмусовым молоком образуется сгусток, пронизанный пузырьками газа.

2 этап. Оценка посева исследуемого материала на СКС или какую-либо среду для выделения анаэробов (анаэробный кровяной агар, среда Китта-Тароцци и т. д.) визуально и микроскопией препаратов, окрашенных по Граму.

Отсев характерных колоний на плотную питательную среду с целью получения и накопления изолированных колоний. Чашки инкубируют в анаэробных условиях.

Оценка результатов посевов:	Микроскопия выделенной культуры, окраска по Граму, х100

На среде СКС___________________________. На кровяном агаре колони:________________.	При микроскопии выявлены крупные грамположительные палочки, образующие споры, превышающие диаметр клетки и занимающие субтерминальное или центральное расположение (споры не окрашены).

3 этап. Характерные колонии отсевают на соответствующие питательные среды для выделения и накопления чистой культуры.

4 этап. Полученная чистая культура подлежит идентификации.

Свойства и методы, позволяющие определить видовую принадлежность. Идентификацию чистых культур (до вида микроорганизма) проводят с учётом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, токсигенных и антигенных свойств микроорганизма. Методы идентификации: культуральная диагностика, РИФ, ПЦР, биохимический метод («пестрый ряд»), биологический (РН) и др.

Оценка посева культуры на «пестрый ряд»

Обнаружение токсина. Тест на лецитиназную активность

Оценка: каталаза (-), разжижение желатина (+), индол (-), глюкоза (+), лактоза (+), сахароза (+), мальтоза (+), пептонизация молока (+), H₂S(+), подвижность (-)

Образец

2,3 Контроль(-)

Проведите идентификацию выделенной культуры по таблице (ниже). Результат________________

5 этап. Оценка результата реакции нейтрализации (РН) на белых мышах с центрифугатом культуральной жидкости и противогангренозными антитоксическими сыворотками.

Для определения токсигенности культуры путем постановки РН смесь центрифугата исследуемой культуры с антитоксическими сыворотками вводят подкожно белым мышам. В случае нейтрализации токсина животные остаются живыми; при отрицательной РН – животные погибают.

№	Введено животным	Результат
культуральная жидкость	антитоксическая сыворотка
1.	+	противоперфрингенс	Мыши живы
2.	+	противонови	Мыши пали
3.	+	противосептикум	Мыши пали
4.	+	противогистолитикум	Мыши пали
5.	+	противосорделлии	Мыши пали
6.	+	--	Мыши пали

Методы, среды и приборы для создания анаэробиоза

Метод Фортнера. Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислорода) — рост анаэробов.

Метод Биттнера. К крышке чашки Петри с посевом исследуемого материала или выделенной культуры анаэробов прикрепляют пакет из фильтровальной бумаги, содержащей пирогаллол, К₂СО₃и тальк. Чашку герметизируют при помощи парафина или скотча. Содержимое пакета увлажняется за счет образующегося конденсата и ингредиенты вступают в реакцию, которая сопровождается поглощением О₂ и выделением СО₂.

Газ-пак (Generbag anaer). Система Generbag anaer состоит из воздухонепроницаемых пакетов, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород.

Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и с помощью специальной скрепки закрыть пакет. Инкубация при 37⁰.

Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон (МПБ), 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции О₂ помещают кусочки вареной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.

Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с 6-7 мл расплавленного и охлажденного до 40-45⁰ полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.

Среда для контроля стерильности (СКС). Рост многих анаэробных микроорганизмов возможен только на средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Поэтому в среды добавляют восстановители, например, тиогликолевую кислоту или ее натриевую соль, цистеин, аскорбиновую кислоту. Функции восстановителей выполняют и другие компоненты среды: глюкоза, пептон. СКС содержит питательный бульон, витаминный препарат ЭКД, NaCl, Na₂CO_3,глюкозу, тиогликолят натрия, цистеин, агар (0,75%). Среду разливают в пробирки по 6-7 мл.

Посевы культивируют в термостате.

Биопрепараты

Наименование	Что содержит	Для чего применяется	Как применяется
Противогангренозные сыворотки диагностические и лечебно-профилактические	представляет собой содержащую специфические иммуноглобулины белковую фракцию сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных анатоксинами (токсинами) трех основных возбудителей газовой анаэробной инфекции (кл. перфрингенс типа А, кл. Новии (эдематиенс), кл. септикум)	Профилактика и лечение гангрены	Профилактическая доза противогангренозной сыворотки составляет 30 000 МЕ (включает по 10 000 МЕ сыворотки активной в отношении токсинов Cl. perfringens, Cl. novyi, Cl. septicum). Лечебная доза суммарно составляет 150 000 МЕ (включает по 50 000 МЕ сыворотки активной в отношении токсинов Cl. perfringens, Cl. novyi, Cl. septicum). Сыворотку вводят медленно в/м, желательно в смеси со стерильным, подогретым до температуры тела физиологическим раствором из расчета 100-400 мл на 100 мл сыворотки. Перед введением основной дозы следует обязательно провести внутрикожную пробу.
Противостолбнячная сыворотка	представляет собой содержащую специфические иммуноглобулины белковую фракцию сыворотки крови гипериммунизированных столбнячным анатоксином и токсином лошадей. Содержит анатоксины, нейтрализующие столбнячный токсин	Профилактика и лечение столбняка
АКДС (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина)	убитые клетки возбудителя коклюша, дифтерийный и столбнячный анатоксины	Профилактика коклюша, дифтерии и столбняка	вводят внутримышечно в верхний внешний квадрант ягодицы или передне-внешнюю область бедра в дозе 0,5 мл (разовая доза). Перед прививкой ампулу необходимо тщательно встряхнуть до получения гомогенной суспензии.
АДС, АДС-М. (Адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин)	Препарат содержит в 1 мл 60 флокулирующих единиц (ЛФ) дифтерийного и 20 антитоксинсвязующих единиц (ЕС) столбнячного анатоксинов.	Профилактика дифтерии и столбняка у детей.

Морфологические свойства микроорганизмов рода Clostridium

Микроскопия чистой культуры C.tetani, окраска по Граму, х100	СЭМ. Морфология C.tetani, х15000

Микроскопия чистой культуры C.botulinum, окраска по Граму, х100	СЭМ. Морфология C.botulinum, х17000

Приложение №2

Медицинская документация

Форма № 204/у

Утв. МЗ СССР 04.10.80 № 1030

НАПРАВЛЕНИЕ №____