Определение чувствительности выделенной культуры к антимикотикам диско-диффузионным методом.

Заболевания, вызываемые патогенными грибами, называются микозами. Классифицируют микозы в зависимости от локализации процесса и агрессивности возбудителя против нормального или ослабленного организма. Выделяют поверхностные (кератомикозы), кожные (дерматомикозы), подкожные, глубокие (системные), оппортунистические микозы и микотоксикозы.

В случае поверхностных микозов развитие грибов происходит на поверхности эпителиальных тканей (эпидермис, волосы, ногти) без пенетрации в живую ткань. Иммунный ответ и воспалительная реакция отсутствуют. Поражения не представляют опасности для жизни, часто не требуют специального лечения и создают лишь косметические проблемы. Примерами таких микозов являются разноцветный (отрубевидный) лишай (возбудитель – Pityrosporum furfur, биовар orbiculare) и себорейный дерматит (P.furfur, биовар ovale).

В случае кожных микозов инфекция ограничена роговым слоем эпидермиса, поражением ногтей и волос. Основная симптоматика обусловлена воспалительной реакцией в эпидермисе, дерме и волосяных фолликулах. Грибковые метаболиты запускают острое воспаление, а проникновение антигенов в эпидермис возбуждает иммунный ответ с развитием гиперчувствительности замедленного типа. Поражения кожи и ногтей (онихомикоз) могут вызвать Candida и (крайне редко) недерматофитные плесени (различные виды Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Fusarium и др.). Это всегда вторичные оппортунистические инфекции, связанные с ослаблением резистентности организма.

Подкожные микозы возникают при травматическом заносе спор грибов-сапрофитов в подкожную ткань (например, с занозами). Возникает хроническая воспалительная реакция (гранулема, иногда с пиогенным компонентом), которая распространяется на кожу (дерму и эпидермис), но обычно не выходит за пределы первичного очага. Чаще подкожные микозы встречаются в странах с тропическим климатом. Повсеместное распространение имеет лишь споротрихоз (Sporothrix schenckii).

Системные (глубокие) микозы являются самыми тяжелыми формами микозов. Возбудители глубоких микозов – диморфные грибы, обитающие в почве или на разлагающихся органических субстратах и встречающиеся в определенных географических областях. Инфицирование человека происходит при ингаляции возбудителя. Первичный очаг размножения – легкие, однако поражение дыхательных путей обычно протекает легко и проходит спонтанно. Реже возникают диссеминированные формы с вовлечением внутренних органов, поэтому группа заболеваний также известна как системные микозы. Прогноз при диссеминированных формах без лечения тяжелый и часто фатальный.

Грибы располагают широким арсеналом адгезивных факторов, которые обеспечивают закрепление на различных тканевых и искусственных субстратах. Колонизация грибков сопровождается продукцией гидролитических ферментов, которые повреждают тканевые барьеры, способствуя пенетрации. Возбудители микозов не продуцируют специфических токсинов, и патогенез сводится к воспалительным процессам в месте грибковой инвазии. В очагах колонизации развиваются гранулемы, иногда с нагноением. Для возбудителей системных микозов характерна инвазия в стенки сосудов с развитием тромбоза, ишемии и тканевого некроза, открывающего путь инфекции в глубокие ткани. К этой группе относится гистоплазмоз (Histoplasma capsulatum), криптококкоз (Cryptococcus neoformans),бластомикоз (Blastomyces darmatidis), кокцидиоидомикоз (Coccidioides immitis) и паракокцидиоидомикоз (Paracoccidioides brasiliens).

Оппортунистические микозы вызывают сапрофитические виды, проникающие из внешней среды либо входящие в состав микробных сообществ организма человека. Патогенность возбудителей очень низкая, и они обычно не вызывают поражения у здоровых лиц, а развиваются лишь в иммунокомпрометированном организме. Группы риска составляют больные диабетом, ожогами, травмами, злокачественными опухолями, недоношенные новорожденные, больные СПИДом и др. Предрасполагающим фактором является длительное использование антибактериальных средств. Большинство возбудителей оппортунистических микозов относится к сапрофитам, которые инфицируют человека через дыхательные пути или пищеварительных тракт. К наиболее известным заболеваниям этой группы относятся аспергиллез (Aspergillus fumigatus), зигомикоз (некоторые виды Rhizopus, Mucor и др.) и пенициллез (некоторые виды Penicillium). Спектр таких микозов постоянно расширяется, прежде всего, в связи с эпидемией СПИДа. Однако чаще всего среди возбудителей вторичных микозов встречается кандидоз – едва ли не единственный оппортунистический микоз эндогенной природы.

Грибы не только используют ослабление иммунитета, но могут активно блокировать иммунные реакции, подавляя функции Т-лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов, комплемента (глиотоксин Aspergillus fumigatus, маннан C.albicans и др.).

Микотоксикозы. Микотоксикозы – группа заболеваний, вызванных попаданием в организм токсичных метаболитов-микотоксинов, образуемых некоторыми плесневыми грибами, колонизирующими пищевые продукты или сельскохозяйственное сырье. Наиболее распространенные возбудители микотоксикозов – грибы рода Aspergillus и Fusarium.

Иммунитет. Микозы (за исключением поверхностных) сопровождаются широким спектром иммунных реакций. Главную роль в противогрибковой защите играют два механизма: Т-зависимые реакции макрофагов, действующие в рамках гранулематозного воспаления и нейтрофилы, поддерживаемые антителами и комплементом. Ослабление любого из трех элементов (фагоциты-антитала-комплемент) снижает коэффициент полезного действия реакции, предрасполагая к инвазивным осложнениям. Неслучайно, что больные с нейтропенией составляют группу риска по развитию генерализованных форм оппортунистических микозов.

Микробиологическая диагностика микозов. Для диагностики микозов применяют микроскопические (в том числе гистологические), микологические (культуральные), серологические, аллергологические, молекулярно-биологические и другие методы исследования. В зависимости от клинических проявлений болезни исследуемым материалом служат: пораженные волосы, чешуйки кожи, кусочки ногтей, кожные и ногтевые скарификаты, гной, мокрота, пунктаты лимфатических узлов, костного мозга, внутренних органов, кровь, спинномозговая жидкость, желудочный сок, желчь, испражнения, кусочки тканей и др. Чтобы лучше рассмотреть пораженный участок пользуются лупой, у больных микроспорией – люминесцентной лампой, в лучах которой пораженные волосы имеют изумрудно-зеленое свечение.

Микроскопический метод. При микроскопическом исследовании изучают окрашенный и неокрашенный (нативный) материал. При микроскопии нативных препаратов можно определить характерное расположение спор в пораженных волосах, мицелия в чешуйках кожи и соскобах с ногтей. Окрашенные препараты готовят из материала, имеющего вязкую или жидкую консистенцию. Чаще всего используют методы окраски по Грамму (клетки грибов, как правило, грамположительны), Романовскому-Гимзе, Гомори (метенаминовым серебром), Мак-Манусу (периодной кислотой и реактивом Шиффа), Цилю-Нильсену и др. При необходимости применяют люминесцирующие иммунные сыворотки (РИФ).

Микологический метод направлен на выделение чистой культуры грибка и ее идентификацию. Посевы производят на плотные и жидкие селективные и неселективные питательные среды Сабуро, сусло-агар, Чапека, кукурузный, рисовый, картофельный агар и др. Культуры инкубируют при 37 и 24 ^оС (комнатной температуре) 2-4 недели, что позволяет выявить диморфизм и ускорить рост сапрофитных грибов, которые медленно размножаются при температуре тела. Грибы любят высокое содержание углеводов и подкисленную воду, задерживающую размножение бактерий. Кроме того, в питательные среды добавляют антибиотики, которые подавляют рост бактерий, не влияют на рост грибов. Возбудители системных микозов растут очень медленно (несколько недель). Культуры идентифицируют по внешнему виду и форме колоний, их консистенции, цвету, способности к росту при 37^оС, микроскопическому строению – характеру ветвления мицелия и наличию в нем септ, расположению конидиеносцев, спор, биохимическим признакам. Как правило, параллельно с микологическим проводится бактериологическое исследование материала.

Биологический метод. Заражение экспериментальных животных проводят для выделения чистой культуры гриба, изучения патогенных свойств возбудителя, испытания новых лекарственных препаратов. Материал вводят животным различными методами, результаты учитывают по характеру выделенной культуры, данным вскрытия животного, гистологического исследования и реакции макрооргнизма.

Серологический метод используется для диагностики гистоплазмоза, бластомикоза и некоторых других микозов. Используют РА, РП, РНГА, ИФА, РИФ, иммуноблотинг.

Аллергологический метод. Аллергические пробы ставят путем внутрикожного введения соответствующих аллергенов (взвеси из убитых грибков, фильтратов культур, полисахаридных и белковых фракций из клеток возбудителей). Результаты учитывают через 20 минут (немедленные) и через 24-48 ч (замедленные реакции).

Гистологическое исследование позволяет обнаружить грибок в тканях, изучить его морфологию и особенности патологического процесса, вызванного им в организме.

Новые подходы к лабораторной диагностики микозов основаны на выявлении в сыворотки крови и других субстратах фунгальных антигенов, например, маннана (кандидоз) и галактоманнана (аспергиллез), специфических метаболитов (d-манитол, щавелевая кислота – аспергиллез) и генетических маркеров в ПЦР. Разработаны тест-системы для ПЦР, позволяющие выявлять до 40 видов грибов, включая все клинически важные виды.

Грибы рода Candida – основные представители оппортунистических микозов. Кандидоз вызывают более десяти видов дрожжеподобных грибов рода Candida (C.albicans, C.tropicalis, C.parapsilosis, C.krusei, C.lusitaniae, C.glabrata и др.). Абсолютным лидером является C.albicans – нормальный комменсал полости рта, кишечника, влагалища и иногда кожи. Кандидоз – самый распространенный из оппортунистических микозов человека, так как носительство C.albicans имеет практически поголовный характер и любое серьезное нарушение местного или общего иммунитета может спровоцировать их активацию. Возможно и экзогенное инфицирование, особенно в госпитальных условиях, что более типично для других видов кандид. Кандидоз проявляется необычайно широким спектром клинических патологий – от ограниченных поражений кожи и слизистых оболочек (молочница, вульвовагинит) до системного поражения мукоидного тракта и гематогенных метастазов во внутренние органы (пневмония, менингит, эндокардит, остеомиелит, артрит и пр.); от поражения ослабленных новорожденных до тяжелых заболеваний иммунокомпрометированных взрослых людей.

Кандиды не относятся к истинным диморфным грибам, так как в тканях можно выявлять как дрожжевые клетки, так и гифы. Переход в мицелярную форму можно наблюдать при культивировании при более низкой температуре (22-25^оС) или при истощении питательной среды. Дрожжевая фаза представлена овальными или круглыми клетками-бластоспорами (4-8 мкм), размножающимися многополюсным почкованием. Мицелиальная фаза представлена цепочками удлиненных клеток, образующими псевдомицелий. На нем беспорядочно располагаются дрожжеподобные бластоспоры. Некоторые виды, включая C.albicans, формируют терминальные хламидиоспоры.

Инфицирование чаще всего происходит эндогенно. Первичная колонизация детей кандидами происходит при прохождении через родовые пути матери или при кормлении грудью. Мочеполовой кандидоз передается половым путем. Различают кандидоз кожных покровов, ногтевых валиков и ногтей, слизистых (молочница), хронический генерализованный (грануломатозный), диссеминированный (висцеральный) кандидоз.

Лабораторная диагностика кандидоза заключается в выявлении возбудителя методами микроскопии, выделения и идентификации чистой культуры гриба, обнаружения в материале его антигенов или ДНК, серологическими методами и аллергическими пробами.

Микроскопическое исследование включает исследование окрашенных и неокрашенных препаратов. По Граму Candida окрашивается в темно-фиолетовый цвет, иногда с розовой центральной частью клетки, по Цилю-Нильсену – в синий с розовато-желтыми включениями липидов, по Романовскому-Гимзе – в розовато-желтый цвет с темно-фиолетовыми включениями волютина и красным хроматиновым веществом. В препаратах обнаруживаются круглые или овальные почкующиеся дрожжеподобные клетки и псевдомицелий. Дифференциацию с патогенными грибами в исследуемом материале осуществляют также с помощью РИФ.

Микологическое исследование. Выделение чистой культуры проводят на плотных средах Сабуро, сусло-агаре, Кандида-агаре или др. Для подавления роста сопутствующих бактерий к этим средам добавляют пенициллин, стрептомицин или другие антибиотики. Посевы инкубируют при 30^оС. Колонии Candida через 2-3 сут имеют средние размеры, беловато-желтый цвет и матовую поверхность, по мере роста они приобретают перламутровый оттенок и у них появляется куполообразное возвышение. Выделенную чистую культуру для выявления псевдомицелия сеют в жидкие среды – картофельную, морковно-картофельный отвар и др. Для идентификации грибов рода Candida определяют тип филаментации, наличие хламидоспор, изучают ферментативную активность (C.albicans ферментируют глюкозу и мальтозу с образованием кислоты и газа). Важным отличительным признаком грибов C. аlbicans является способность образовывать ростовые трубки – трубкообразные выросты бластоспор (признак РТ).

Серологическое исследование. Серодиагностику проводят обычно при висцеральных формах кандидоза. Используют РА, РНГА, ИФА, которые проводят с парными сыворотками.

Аллергологическое исследование. При проведении аллергической пробы используют стандартный кандидозный аллерген – взвесь клеток грибов (200 млн в 1 мл), прогретую при 80^оС в течение 2 ч. Аллерген в объеме 0,1 мл вводят внутрикожно, для ослабленных детей разводят в 10 раз. Результаты реакции (гиперемия, папула) учитывают через 24-48 ч. может служить показателем эффективности индивидуальных иммунных реакций на антигены грибов рода Candida.

Для диагностики инфекции, вызванной C. albicans используют ПЦР.

ЗАНЯТИЕ № 27