Знакомство с методикой забора водопроводной воды для бактериологического исследования

2. Знакомство с методикой определения титра водопроводной воды и воды открытого водоема. Составить схему

3. Знакомство с методикой определения индекса водопроводной воды и воды открытого водоема. Составить схему

4. Знакомство с методикой определения количества микроорганизмов в воздухе. Оформить протокол

1. Забор воды для бактериологического исследования

Забор воды для бактериологического анализа производят в стерильные бутыли из стекла или одноразовую посуду емкостью не менее 500 мл с резиновыми или силиконовыми (но не ватно-марлевыми), плотно закрывающимися, пробками и защитными колпачками из алюминиевой фольги или плотной бумаги. Водопроводный кран, без резиновых шлангов и предварительного обжига, открывают, спускают воду и без изменения напора собирают не менее 500 мл воды. Емкости с пробами должны быть заполнены так, чтобы между водой и пробкой оставалось пространство (для предотвращения смачивания пробки при транспортировке). Пробы в емкостях закрывают проб­ками и стерильными колпачками, маркируют, прикрепляя этикетки или нанося надпись несмываемой краской, составляют акт о взятии проб воды, с указанием места и времени, даты отбора проб, харак­теристики водоисточника (температура воды, климатические условия окружающей среды), фамилию лица, взявшего пробу.

Пробы питьевой воды должны быть помещены в контейнер-холодильник при температуре 4–10°С. Бактериологическое исследование должно производиться не позднее 6 часов с момента отбора проб, если пробы нельзя охладить, то прове­дение исследования должно состояться не позднее, чем через 2 часа после забора. Загрязненность воды определяется по общей микробной обсемененности и обнаружению санитарно-показательных микроорганизмов – индикаторов наличия выделений человека и животных.

Для изучения общей обсемененности исследуемой воды определяют общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (МАФАМ), способных в результате инкубации при 37°С в течение 24 часов образовывать, видимые невооруженным глазом или при увеличении в два раза, колонии на питательной среде. Исследуют общее число МАФАМ в 1 мл воды.

2. Определение общего числа микроорганизмов в воде, образующих колонии на питательной среде. Составить схему. Оформить протокол

При исследовании водопроводной воды берут не менее 2-х объемов по 1 мл; вода водоемов: чистая – 1,0; 0,1 мл; загрязненная – 0,01; 0,001 мл.

Для посева объемов 0,1 мл и меньше, исследуемую воду разводят стерильной дистиллированной водой, готовя 10-кратные разведения. По 1 мл каждого разведения засевают на пита­тельную среду.

1 день

На дно стерильной чашки Петри наливают по 1 мл исследуемой воды (из каждой пробы не менее двух объемов), в эту же чашку выливают 8–12 мл МПА, расплавленного и остуженного до 45–49°С, интенсивно перемешивают питательную среду с во­дой, оставляют чашку на горизонтальной поверхности до застывания агара, после чего помещают в термостат на 24 часа при 37°С.

2 день

Подсчитывают все выросшие колонии (учитывают чашки, на которых выросло не более 300 изолированных колоний) и производят расчет. Результат выражают в колониеобразующих единицах (КОЕ) в 1 мл воды.

Общее количество МАФАМ воды в 1 мл не должно превышать 50.

Загрязненность воды относительно санитарно-показательных микроорганизмов определяется по наличию общих и термотолерантных колиформных бактерий.

Общие колиформные бактерии (ОКБ) – это грамотрицательные палочки, неспорообразующие, растущие на лактозосодержащих средах типа Эндо, сбраживающие лактозу (маннит, глюкозу) с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24-48 часов и не обладающие оксидазной активностью.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТБК) – это грамотрицательные палочки, неспорообразующие, растущие на лактозосодержащих средах типа Эндо, сбраживающие лактозу с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 44°С в течение 24 часов, не обладающие оксидазной активностью и не растущие на цитратной среде.

 

Определение общих и термотолерантных

колиформных бактерий в воде

Объем исследуемой воды зависит от степени бактериального загряз­нения воды:

водопроводная вода – 3 объема по 100,0 мл;

вода водоемов: чистая – в объеме 100,0; 50,0; 10,0; 1,0 мл; загрязненная сточными водами – в объеме 10,0; 1,0; 0,1; 0,01 мл; в зоне влияния выпуска сточных вод – 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл.

Определение ОКБ и ТБК в воде, согласно действующим МУ 2.1.4.1018-01, проводится мембранным и титрационным (бродильным) методами. Титрационный метод используется, если нет возможности провести исследование мембранный методом, по причине отсутствия материалов и оборудования, необходимых для выполнения или наличия в воде большого количества взвешенных частиц, микрофлоры, препятствующей получению изолированных колоний на фильтрах.

а) Определение ОКБ и ТБК в воде методом мембранной фильтрации.

Исследование воды при помощи мембранных фильтров основано на задержании на поверхности и в теле фильтра всех или почти всех бактерий, находящихся в воде, с последующим выращиванием на плотной питательной среде.

1 день

Исследуемые пробы фильтруют через мембранные фильтры (для получения стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл через один фильтр). Используют фильтровальный аппарат Зейтца. После окончания фильтрации фильтр снимают стериль­ным пинцетом и помещают фильтрующей поверхностью на среду Эндо по 3–4 фильтра, так чтобы они не соприкасались. Чашки с фильтрами инкубируют в термостате 24 часа при температуре 37°С.

2 день

Учету подлежат все красные и темно-красные колонии, с металлическим блеском и без него, выросшие на фильтрах. Подсчитывают число колоний каждого типа. Идентифицируют каждую выбранную изолированную колонию по морфологическим свойствам – готовят мазки-препараты и окрашивают по Граму; по биохимическим свойствам – способность ферментировать лактозу с образованием кислоты и газа, оксидазную активность (для постановки пробы на оксидазу со среды Эндо снимают по 2–3 колонии каждого типа, наносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной диметилпарафенилендиамином). При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не меняется, при положительном – бума­га окрашивается в синий цвет в течение 1 мин. По 2–3 колонии каждого типа пересевают на среды Гисса с лактозой и инкубируют при 44°С в течение 24 часов.

 

Результат анализа рассчитывают по следующей формуле:

Х = а х

V

где Х – число колоний в 100 мл исследуемой воды; V – профильтрованный через фильтр объем воды; а – число всех колоний, выросших на фильтрах.

Полученный результат выражают в КОЕ в 100 мл воды.

Общие и термотолерантные колиформные бактерии должны отсутствовать в 100 мл исследуемой воды.

 

б) Определение ОКБ и ТБК в воде титрационным (бродильным) методом

В качестве среды накопления используют глюкозопептонную среду, с индикатором бромтимоловым синим и поплавком.

1 день

При исследовании водопроводной воды делают посев 3 проб по 100,0 мл, 3 проб по 10,0 мл и 3 проб по 1,0 мл;

воды водоемов: не загрязненных сточными водами – в объеме 10,0; 1,0; 0,1; 0,01 мл; загрязненных сточными водами – в объеме 1,0; 0,1; 0,01; 0,001 мл; в зоне влияния сточных вод – в объеме 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл.

Причем, для посевов боль­ших объемов (100 мл и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую десятикратные количества необходимых веществ, а малые объемы засевают в обычную глюкозопептонную среду. Посевы инку­бируют в течение 24 часов при 37°С.

2 день

Изучают посевы. Обращают внимание на помутнение среды, измене­ние ее окраски, что говорит об образовании кислоты из глюкозы, появление пузырьков газа в поплавке или ватке. Отсутствие измене­ния в среде уже на этом этапе позволяет закончить исследование и дать отрицательный результат.

Из проб с лактозоположительным ростом делают посевы секторами на чашки со средой Эндо. Посевы помещают в термостат при 37°С на 24 часа.

3 день

Просматривают посевы на среде Эндо, учитывают темно-красные или красные колонии, с металлическим блеском или без него. Идентифицируют каждую выбранную изолированную колонию по морфологическим свойствам – готовят мазки-препараты и окрашивают по Граму; по биохимическим свойствам – способность ферментировать лактозу с образованием кислоты и газа, оксидазную активность. По 2–3 колонии каждого типа пересевают на среды Гисса с лактозой и инкубируют при 44°С в течение 24 часов.

Розовые, бесцветные, пленчатые колонии и колонии грибов на среде Эндо не учитываются.

При обнаружении, хотя бы в одном из трех объемов питьевой воды, ОКБ и ТБК, выдают ответ о наличии таковых в 100 мл исследуемой воды. Расчет количественным методом проводят по специальным таблицам 5 и 6.

 

Таблица 5