Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


√азовый состав ростовых сред




Ќаличие кислорода в среде культивировани€ €вл€етс€ одним из факторов, обеспечивающих рост культуры. ѕри культивирова≠нии клеток в малых объемах потребность клеток в кислороде мо≠жет быть обеспечена за счет обдувани€ поверхности среды возду≠хом или же смесью 95 % воздуха и 5 % углекислого газа.

ѕроблема обеспечени€ клеток кислородом возникает при крупномасштабных объектах культивировани€. Ёто св€зано с тем, что кислород очень плохо растворим в культуральных средах, а по≠требность клеток в нем и скорость его использовани€ достаточно высока€. » в таких случа€х кислород €вл€етс€ лимитирующим фак≠тором роста клеток в реакторе.

–ешение проблемы обеспечени€ культур клеток кислородом осуществл€етс€ интенсивной аэрацией среды стерильным возду≠хом и непрерывным контролем концентрации кислорода в среде.

¬ажным компонентом газовой смеси €вл€етс€ двуокись угле≠рода, котора€ может служить источником бикарбоната и поддер≠живать величину рЌ. ƒл€ большинства клеток оптимальна€ кон≠центраци€ —02 находитс€ в пределах 0,5-2%.

¬ процессе культивировани€ клетки могут инфицироватьс€ различными микроорганизмами (контаминантами). Ёкономические убытки от контаминации столь значительны, что часто возникает необходимость включени€ антибиотиков в культуральные среды, что обеспечивает биологическую чистоту культуры. ѕри этом не≠обходимо учитывать, что антибиотики угнетают и рост самой куль≠туры. ѕоэтому антибиотики подбирают так, чтобы обеспечить ингибирование роста контаминантов с минимальным ингибированием роста культур клеток.

 

Ќаиболее часто примен€ют такие антибиотики как пенициллин (100 ћ≈/мл), стрептомицин (50 мкг/мл) или гентамицин (50 мкг/ мл), которые €вл€ютс€ мощными антибактериальными агентами. ¬ качестве противогрибковых агентов используют амфотерицин ¬ (25 мкг/мл) или нистатин (25 мкг/мл).

ЂЌеопределенныеї биологически активные добавки к сре≠дам дл€ культивировани€ клеток

ѕитательные среды не способны обеспечить интенсивный рост клеток в культуре. ¬ таких средах (среда »гла, среда 199, среда ’епа Ѕ-10), клеточные культуры способны сохран€тьс€ в хорошем состо€нии в течение нескольких недель и их свойства остаютс€ неизменными. “акие среды называют поддерживающи≠ми средами. ¬несение в поддерживающие среды сыворотки крови новорожденных тел€т или лошадей в концентраци€х от 0,5 до 30 % по объему обеспечивает рост культуры клетокмлекопитающих в системе in vitro. » в таком случае такие среды называют росто≠выми. Ќеобходимо отметить, что тел€чь€ эмбриональна€ сыворот≠ка превосходит по ростовым свойствам другие виды сывороток. ”становленным фактом €вл€етс€ то, что в сыворотке высокое со≠держание биотина и других факторов роста.

—ыворотку получают либо от эмбрионов, либо от новорожденных тел€т. ѕолучение сыворотки, ее обработка и стерилизаци€ достаточно сложные задачи, решение которых требует специальной аппаратуры. ѕри получении сыворотки необходимо устранить гемолиз эритроци≠тов, осуществить ее очистку от вирусов, микоплазм и бактерий. ƒл€ этого ее фильтруют через серию фильтров с диаметром пор до 0,1 мкм. “естируют на отсутствие вирусов и способность обеспечивать рост клеток в культуре. –азные партии сыворотки крови могут существен≠но различатьс€ по своим ростовым свойствам. ѕолученную сыворотку хран€т при минус 20∞—, ежемес€чно провер€ют ее свойства, она мо≠жет хранитьс€ 6 и более мес€цев, повторных циклов замораживани€-оттаивани€ не допускаетс€.

—ыворотка содержит более 1000 различных молекул, и пока еще не установлена св€зь между биохимическими и биофизическими свойства≠ми сыворотки и ее способностью ускор€ть рост клеток т уЌго. ќднако целый р€д функции сыворотки в росте клеток уже установлен (табл. 21).

»спользование сыворотки в питательных средах создает и це≠лый р€д серьезных проблем (табл. 22). » эти проблемы, по мнению многих специалистов, могут быть решены только путем перехода на так называемые бессывороточные среды или среды с определен≠ным составом.

Ѕессывороточные среды

»спользование бессывороточных сред или сред с заменой наи≠более важных дл€ роста клеток компонентов сыворотки позвол€ет: улучшить воспроизводимость экспериментальных результатов и обеспечить стабильную продуктивность культур; значительно сни≠зить веро€тность заражени€ культуры вирусами или микоплазмами. »спользование таких сред позвол€ет обеспечить относительно простую систему очистки продуктов метаболизма клеток.

 

ѕќЋ”„≈Ќ»≈ »  ”Ћ№“»¬»–ќ¬јЌ»≈ ѕ≈–¬»„Ќџ’  ”Ћ№“”–  Ћ≈“ќ 


 ультивирование клеток в виде моносло€

Ўтаммы и линии клеток могут быть получены от различных фирм - поставщиков, или из коллекции клеточных культур.

ћаточные культуры хран€тс€ и транспортируютс€ в жид≠ком азоте и в твердой углекислоте, при температуре сухого льда. ѕоскольку клетки при температуре сухого льда обладают низ≠кой жизнеспособностью, то сразу после их получени€ необхо≠димо начать их культивирование или перезаморозить их в жид≠ком азоте. ¬ таком виде их можно хранить сколько угодно долго. “ранспортировать клетки можно и в виде моносло€. —осуды при этом должны быть просто закупорены.

Ќар€ду со стационарными лини€ми клеток (ЌеLа,) в культи≠вировании используютс€ и первичные культуры клеток.

ѕервичными клеточными культурами называют клетки, по≠лученные от животного, и которые поддерживаютс€ в культуре до начала субкультивировани€.

¬ качестве примера рассмотрим способ получени€ фибробла≠стов кожи.

¬ыбрать участок кожи и обработать его стерилизующими агентами (70 % этанол). ¬ырезать стерильный участок 1 мм2 и пе≠ренести его в стерильную чашку ѕетри. ƒобавить в чашку ѕетри несколько капель полной ростовой среды (например, минималь≠на€ среда ƒульбекко) с 10 % эмбриональной сывороткой теленка и разрезать стерильным скальпелем кусочек на 5-10 маленьких кусочков.

»нкубировать кусочки при 37 ∞— в течение ночи. ѕосле это≠го осторожно, чтобы не сместить фрагменты, добавить в чашку 3 мл полной среды и продолжать инкубацию. –ост фибробластов из фрагментов кожи может происходить в течение недели.

Ћегко получают первичную культуру макрофагов мыши. ƒл€ этого стерилизуют кожу брюшной стенки 70 % этиловым спир≠том. ѕосле этого удал€ют кожу с брюшной стенки. »нъецируют в брюшную полость 2,5 мл ростовой среды с 10 % сывороткой телен≠ка и 10-ю единицами гепарина. «атем массируют брюшную стенку дл€ отделени€ макрофагов в суспензию.

ќтсасывают брюшную жидкость стерильной иглой и пере≠нос€т суспензию в стерильную чашку ѕетри, считают количество клеток и распредел€ют их по чашкам так, чтобы в чашке было 10б клеток. ¬ течение 30 мин макрофаги прикрепл€ютс€ к чашке, а со≠путствующие лимфоциты и фибробласты могут быть легко удале≠ны сменой среды.

¬ насто€щее врем€, кроме первичной культуры макрофагов получены и стационарные линии макрофагов.

 летки способны прикрепл€тьс€ к поверхности культурального сосуда и формировать монослой клеток. “акой тип культиви≠ровани€ называют монослоем. ѕри достижении монослем границ культурального сосуда рост клеток может прекращатьс€. Ёто €вле≠ние получило название контактного торможени€, так как при пол≠ном заполнении поверхности дальнейший рост клеток тормозитс€.

 ультивирование клеток в виде моносло€ имеет р€д преиму≠ществ перед суспензионным культивированием, т.е. культивирова≠нием клеток в виде суспензии, которое обеспечиваетс€ непрерыв≠ным перемешиванием суспензии клеток.

 ультивирование клеток в монослое позвол€ет: легко мен€ть культуральную среду, так как клетки прикреплены к поверхности; получать высокий уровень экспрессии клеточных продуктов, так как у клеток прикрепленных к субстрату эффективнее экспрессируютс€ клеточные продукты; обеспечить максимальную гибкость исследо≠ваний, поскольку может использоватьс€ дл€ любого типа клеток.

Ќар€ду с этим, монослойна€ культура имеет и недостатки по сравнению с суспензионными культурами: возникают трудности при увеличении масштаба культивировани€; требуют больших пространств; трудно определ€ть динамику роста клеток; трудно обеспечивать гомогенность клеток.

ћеханизм прикреплени€ клеток к поверхности (стекло или пластик) может обеспечиватьс€ электростатическими взаимодей≠стви€ми. ¬ажным фактором в этом случае €вл€етс€ суммарныйотрицательный зар€д. ƒл€ увеличени€ эффекта взаимодействи€, в частности органических поверхностей, провод€т химическую обработку (окисл€ющими агентами, кислотами) или физические воздействи€ (электрический разр€д, облучение ультрафиолетом, бомбардировка электронами высоких энергий).

ѕоверхность культурального сосуда может быть покрыта ве≠ществом, которое облегчает прикрепление клеток. „аще всего дл€ этого используетс€ коллаген и полиаминокислоты.

 летки могут расти на мелких сферических носител€х. ¬ таком случае они могут рассматриватьс€ как клеточные суспензии и дл€ их выращивани€ могут примен€тьс€ процессы и аппараты, разра≠ботанные дл€ суспензионных культур. “акое культивирование ис≠пользуетс€ в промышленности дл€ получени€ вакцин и интерферо≠на в ферментерах объемом до 1000 л. ѕри этом культивировании используютс€ первичные культуры клеток.

  сожалению, успешное выращивание клеток человека получаетс€ только в ферментерах лабораторного типа (объем реакторов до 20 л).

’от€ большое количество клеток животных вообще не выжи≠вают в суспензионных культурах, дл€ сохранени€ жизнеспособ≠ности им необходимо образование межклеточных контактов (на≠пример, культуры клеток человека WJ-88, ћR—-5), суспензионные культуры более технологичны и их используют дл€ наращивани€ клеточной массы.

 

 

—”—ѕ≈Ќ«»ќЌЌџ≈  ”Ћ№“”–џ

 летки крови лучше растут в суспензионной культуре по срав≠нению с монослойными культурами. ƒл€ перевода клеток в суспен≠зионную культуру используют различные способы адаптации к их росту в суспензии.

ќдним из способов получени€ суспензионной культуры €вл€≠етс€ селекци€ или система отбора. —пособ основан на том, что в среде клеток, растущих в монослое, существуют клетки способные к росту в суспензии, их отбирают и в процессе длительной селек≠ции получают клетки, способные расти в суспензии. “ак были по≠лучены суспензионные культуры LS из L-929 и ЌеLа-53 из ЌеLа.

ƒругим подходом к получению суспензионных культур €вл€≠етс€ адаптаци€ клеток к росту в суспензии. ƒл€ этого культуры интенсивно пересаживают и культивируют в суспензии, отбирают клетки, которые адаптированы к росту в суспензии. ќднако всегда существует веро€тность возврата клеток к росту в монослое.





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-05-07; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 808 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

—амообман может довести до саморазрушени€. © Ќеизвестно
==> читать все изречени€...

2295 - | 2143 -


© 2015-2024 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.014 с.