Ход бактериологического исследования

Первый день. Все поступившие материалы засевают на 5% кровяной агар штрихом, тщательно втирая их по секторам с целью получения отдельных колоний. Посевы помещают в термостат при 37⁰ град. С.

Одновременно с посевами из поступившего материала готовят 2-3 мазка, один из которых окрашивают по Граму. Мазки просматривают под микроскопом с иммерсией. Обнаружение грамположительных палочек с характерной морфологией и расположением позволяет заподозрить наличие коринебактерий. Для уточнения проводят микроскопию мазков, окрашенных щелочным раствором метиленового синего. Если в мазках видны слегка изогнутые изящные палочки с булавовидными утолщениями на концах, располагающиеся в виде войлока, пакета булавок, цифры V, содержащие темно - окрашенные зерна на концах, то следует заподозрить наличие С. diphtheriae, о чем срочно сообщить лечащему врачу и далее вести исследование в соответствии с Инструкцией «Лабораторная диагностика дифтерии», Приложение 2 к Приказу МЗ РБ №42 от 09.02.2002г.

У других видов коринебактерий палочки более толстые, короткие, обычно располагаются в виде частокола; реже встречаются булавовидные утолщения и темно - окрашенные зерна, расположенные на одном конце.

При микроскопии первичных мазков (особенно приготовленных из гнойного отделяемого) можно наблюдать своеобразную морфологию клеток, напоминающую по расположению коринеформные бактерии: грамположительные длинные тонкие или короткие толстые палочки с утолщениями на одном конце. В отличие от коринебактерий четко видны или ветвящиеся формы, или раздвоение на концах палочек, коккобациллярные клетки, располагающиеся парами или цепочками. Такая морфология микробов характерна для микробов родов Actinomyces, Bifidobacterium, Lactobacillus, Propionibacterium. Эта группа грамположительных, не образующих спор палочек, включает микроаэрофильные и облигатноанаэробные формы. Поэтому при посеве материала на кровяной агар, рост культур этих микроорганизмов или отсутствует, или может появиться на 3-5 сутки инкубации в виде очень мелких сероватых крошковидных колоний (Actinomyces israelii, Propionibacterium acne).

Второй день. Через 20-24 часа все посевы просматривают на наличие роста культуры. На кровяном агаре можно наблюдать рост колоний, которые, в зависимости от вида коринебактерий, имеют некоторые особенности строения и своеобразную морфологию клеток.

Колонии, размером от 1 до 2-3 мм, чаще круглые, непрозрачные, сероватые (S-форма) или шероховатые, крошковидные, исчерченные, с неровным краем колонии (R-форма), и под ними зона полного гемолиза эритроцитов.

В мазках из выросших колоний, окрашенных по Граму, видны грамположительные прямые или слегка изогнутые полиморфные палочки, располагающиеся кучками в виде рассыпанных булавок или римской цифры V или буквы L. Палочки не ветвятся, клетки содержат метахроматические зерна (С. diphtheriae, С. ulcerans, С. pseudotuberculosis).

Колонии круглые, непрозрачные, маслянистые мелкие или крупные, кремовые, бледно - желтые, оранжево - коричневые, гладкие без зон гемолиза.

В мазках из крупных колоний равномерно окрашенные грамположительные палочки расположены частоколом. Встречаются редкие булавовидные и зернистые с одного конца формы (С. xerosis, С. pseudodiphthericum). В мазках из мелких колоний видны полиморфные грамположительные булавовидные, четкообразные палочки, иногда коккоидные формы с маленькой краевой капсулой (С. enzymicum).

Очень мелкие до 1 мм или крупные 1-2 мм колонии, гладкие, круглые, непрозрачные, окруженные большой прозрачной зоной полного гемолиза эритроцитов. В мазках из описанных колоний видны мелкие грамположительные коккобациллы, которые расположены в виде разреженных цепочек или пунктира, они напоминают стрептококки, но это - дифтероидные формы коринебактерий (С. pyogenes, С. haemolyticus).

Для выделения чистых культур и накопления биомассы описанные колонии отсевают на 10% сывороточный агар.

Если на чашках с кровяным агаром обнаружен рост однотипных колоний с идентичной морфологией клеток, то культуру, снятую петлей с питательной среды, исследуют для выявления наличия ферментов уреазы, желатиназы и способность утилизировать углеводы (см. таблицу 11).

Третий день. Из культур, выросших на сывороточном агаре, делают мазки, окрашивают по Граму для подтверждения наличия грамположительных палочек, характерных по морфологии и расположению для коринебактерий. Культуру используют для идентификации по тестам, представленным в таблице 11. При необходимости культуру используют для оценки чувствительности к антибиотикам.

Регистрируют результаты изучения биохимических свойств штаммов из однотипных колоний с кровяного агара. Если свойства культуры соответствуют одному из видов коринебактерий, то исследования заканчивают и дают ответ о выделении соответствующего вида. (Таблица 11).

Наблюдение за посевами крови, которые выдерживают в термостате, ведут ежедневно. При выявлении роста и обнаружении в мазках, окрашенных по Граму, клеток, характерных для коринебактерий, делают высев на 10% сывороточный агар. Идентификацию выделенных культур проводят по этапам, описанным выше.

Четвертый день. Проводят учет результатов по биохимическим тестам для идентификации выделенных культур. В соответствии с данными таблицы 11 дают ответ о выделенном из исследуемого материала виде коринебактерий. Для потенциальных возбудителей заболевания указывают чувствительность культур к антибиотикам.

Таблица 11

Биохимические свойства микробов рода Corynebacterium.

Примечание:*- тесты, обязательные при идентификации возбудителя дифтерии; …- нет данных; (+)- слабая положительная реакция; d - Реакция, вариабельная у разных штаммов; ¹- Выделяют из крови ослабленных больных; ² +/-: + мелкие колонии; - крупные колонии.

Тесты на цистиназу, расщепление крахмала и определение экзотоксина проводятся в соответствии с Инструкцией «Лабораторная диагностика дифтерии», Приложение 2 к Приказу МЗ РБ №42 от 09.02.2002г.