Специфичность иммуноанализов

Есть еще и такие характеристики диагностических тест-систем, как положительная предсказательная значимость (ППЗ) и отрицательная предсказательная значимость (ОПЗ). Чтобы пользоваться данными характеристиками (и это отличает их от приведенных выше

чувствительности и специфичности), необходимо знание реальной распространенности данного инфекционного заболевания в обследуемых популяциях населения.

ППЗ рассчитывают как частоту встречаемости инфицированных людей среди всех индивидуумов, определенных данной тест-системой как позитивные:

ОПЗ тест-системы рассчитывают как частоту неинфицированных людей среди всех индивидуумов, определенных данной тест-системой как отрицательные:

4.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК, СЕКРЕТИРУЮЩИХ ТОТ ИЛИ ИНОЙ ПРОДУКТ, - МЕТОД ELISPOT

Метод ELISPOT (Enzyme-linked immunospot, spot - пятно) был разработан в 1983 г. двумя группами авторов (Sedgwick J.D., Holt P.G., Czerkinsky C.C. et al.) для подсчета числа антителообразующих клеток. ELISPOT пришел на смену знаменитому методу локального гемолиза в агаре Н. Йерне.

Идея метода ELISPOT состоит в использовании культуры клеток in vitro при проведении ловушечного твердофазного иммуноанализа на пористой поверхности (рис. 4.12, см. также цв. вклейку). В настоящее время промышленность выпускает планшеты для культивирования (чаще всего 96-луночные, той же стандартной формы, что и планшеты для ИФА), дно которых покрыто нитроцеллюлозной мембраной. На нитроцеллюлозе сорбируют интересующий антиген, после чего в лунки помещают лимфоциты в полноценной культуральной среде и культивируют их в оптимальных для живых клеток условиях (СО₂-инкубатор, оптимальная плотность посадки клеток, все необходимые метаболические добавки и т.д.). Через несколько часов или

Рис. 4.12. Общий принцип метода ELISPOT для определения количества клеток, секретирующих цитокины

1, 2, 3 сут (условия подбирают опытным путем) клетки тщательно вымывают из лунок в проточной системе физраствором или водой с детергентом (например, 0,1% Tween-20 или др.).

Если какие-то клетки секретировали антитела против антигена, сорбированного на дне, то на этом дне фиксируются иммунные комплексы «антиген-антитело». Затем добавляют антииммуноглобулиновый конъюгат с ферментом, инкубируют, промывают, добавляют бесцветный субстрат. Фермент, остающийся после промывок только в точках, в которых лежали во время культивирования антителообразующие клетки (пористая поверхность не позволяет клеткам «кататься» по дну лунок), катализирует образование цветного продукта. В результате на дне лунок образуются окрашенные пятна в тех точках, над которыми лежали антителообразующие клетки (АОК). Первоначально пятна пытались подсчитывать визуально. Получали нечеткие субъективные результаты. Вскоре разработали несложное приборное оборудование, состоящее из миниатюрной видеокамеры, которая фиксирует изображение каждой лунки планшета и в цифровом виде отправляет эту информацию в компьютер. С помощью специально созданного программного обеспечения (самый дорогостоящий компонент метода) стали проводить анализ данных, сравнивая опытные лунки с контрольными и определяя количество искомых клеток на (например) 10⁶ общего числа клеток в исследуемой суспензии.

Вскоре стало очевидно: метод ELISPOT весьма универсален и пригоден для под-

счета, скажем, клеток, продуцирующих тот или иной цитокин. В данном случае первым слоем на дно специальных планшетов для ELISPOT сорбируют моноклональные антитела против интересующего цитокина. Затем помещают в лунки культуру исследуемых клеток. Специфическим и творческим моментом в данном случае является добавление в культуру стимуляторов продукции заданного цитокина. Дальнейшие этапы выполнения метода те же, что при подсчете АОК.

Метод ELISPOT, несмотря на весьма высокие цены на реагенты и приборы, включен в международные протоколы обязательных исследований при разработках и клинических испытаниях вакцин. Мы приведем в качестве примера более подробный протокол методики с применением для повышения чувствительности авидин-биотиновой системы. Методика в целом включает два этапа:

1-й - стерильное культивирование живых и функционирующих

клеток;

2-й - иммуноанализ в тех же планшетах, но уже в нестерильных условиях.